NY∕T 3196-2018 热带作物病虫害检测鉴定技术规程 芒果畸形病(农业)
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ID： |
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文件大小(MB)： |
0.83 |
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页数： |
10 |
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日期： |
2021-12-23 |
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ICS 65.020,B 16 NY,中华人民共和国农业行业标准,NY/ T 3196-2018,热带作物病虫害检测鉴定技术规程,芒果畸形病,Technical code of practice for detection and identification of tropical crop,diseases and insect pests-,Mango malformation disease,20 ↑ 8-03-15 发布2018-06-01 实施,中华人民共和国农业部发布,目。吕,本标准按照GB/ T 1. 1-2009 给出的规则起草,本标准由农业部农垦局提出,本标准由农业部热带作物及制品标准化委员会归口,本标准起草单位:中国热带农业科学院环境与植物保护研究所,本标准主要起草人:蒲金基、张贺、漆艳香、张欣、喻群芳、谢艺贤、陆英、张辉强,NY/T 3196-2018,I,NY!T 3196-2018,热带作物病虫害检测鉴定技术规程芒果畸形病,范围,本标准规定了芒果畸形病病原菌一一一芒果镰抱菌CFusarium mangz后rae Britz , Wingfield et Mara,sas) 鉴定方法,本标准适用,2 鉴定原理,3,4,4. 1,按附录,做样本， 装,4.2 PCR,4. 2. 1 基因,见附录,4. 2.2 引物,在PCR 官',液CMg卜Plus)2.,1), Taq 酶O . 2μL ,引物名称,1- 3F,1-3R,或花序,589 bp,反应条件:95.C 预变性3 min ，后3 0 个循环为95.C 变性4 0 s; 58.C 退火4 5 S; 72.C 延伸1 mi n; 最后,72.C延伸10 min . 取出PCR 反应管，对反应产物进行电泳检测或4.C 条件下保存，存放时间不超过,24 h ,4. 2. 3 反应体系中的对照设置,以病原菌Fωα rium mangiferae 基因组DNA 作为模板的为阳性对照; 以健康芒果果实种胚组织,提取的基因组DNA 作为模板的为样品阴性对照;以配制反应体系的无菌超纯水代替DNA 模板的为,PCR 反应体系阴性对照,NY/T 3196一2018,4. 2 4 PCR 产物凝胶电泳检测,4. 2. 4. 1 凝胶制备,见附录B ,4. 2. 4 2 加样与电泳,见附录B ,4. 2. 4. 3 凝胶成像分析,将整块琼脂糖凝胶置于紫外凝胶成像仪观察窗内，根据DNA 分子量标准估计扩增条带的大小，并,拍照保存， PCR 检测结果电泳图见图1 ,2α)() bp,1 ()()() hp,750 hp 一--. E EE 』E 589 bp,5∞ hp,250 bp,l ∞ bp,说明:,M 一一D:可A 分子量标准5一一样品阴性对照.,阳性对照， 6一-PCR 反应体系阴性对照.,2-4 一一阳性样品.,图1 芒果镰于包菌特异性引物PCR 检测结果电泳图,4. 3 菌株分离培养,从发病部位切取组织、块( 0 . 1 cm XO. 1 cm) ，在无菌操作台上，用70 % 乙醇表面消毒5 s~1 0 s 后于,0.1 % 升柔溶液中浸泡1 min ，再用无菌水漂洗3 次，无菌滤纸吸千水后置于PDA 培养基中，放置25.C,恒温箱中培养，待菌落形成. 利用单抱分离法对分离物进行纯化、归类、编号和保存,4. 4 致病性测定,接种材料为健康盆栽2 年生芒果幼苗。采用活体接种，将分离纯化的各种菌株分别在马铃薯葡萄,糖培养液(即PDB>中、25.C 恒温振荡培养6 d 后，过滤除菌体，配置成约1 X 1 0' 个/ mL 分生于包子悬浮,液。在健康苦果茵腋芽下约3cm 处用微型注射器注射0 . 1 mL 悬浮液，对照接等量无茵水，敷湿润海绵,并套袋保湿培养3 d ，每处理重复30 次。观察记录发病情况，与自然发病症状做对比。待接种腋芽发病,后对病组织再分离验证,4. 5 菌株保藏,将单抱分离、纯化的菌株移植于PDA 培养基斜面试管上， 2 5 .C 培养7d 后， 4.C保存,5 判定规则,5. 1 PCR 结果判定,5. 1. 1 PCR 反应体系的判定标准,PCR 反应体系的判定标准见表2 ,2,Y! T 3196-2018,表2 PCR 反应体系的判定标准,要1)定依据判定条件结论,样品对照或PCR 反应体系阴性对照出现PCR 反应体系t作不正常， 样品检测结果不能作为判定的,PCR 反应,目的条带依据， 需重新准备PCR 试剂和阳性对照， 并重新进行样品的,阳性对照未出现目的扩增条带PCR 复测，具体操作按照4 目2 的规定执行,体系,阳性对照出现目的扩增条带， 而样品对照PCR 反应体系正常，样品PCR 检测结果可以作为判定的,和PCR 反应体系阴性对照均不出现该条带依据,41,:,5. 1.2 待检样品阳性或阴性结果判定,PCR 反应体系正常的条件下，待检样品未出现目的扩增条带，则重新提取待检样品基因组DNA ,进行PCR 复测， 仍未出现目的扩增条带， 则判定该样品未携带芒果镰抱菌,PCR 反应体系正常的条件下，待检样品出现目的扩增条带， 则初步判断该样品为阳性，携带芒果镰,抱菌,5. 2 菌落特征和病原商形态识别,菌落特征和病原菌形态特征同A . 5 ,5. 3 致病性测定结果判定,致病性测定结果同A.2 ,当表现为芒果畸形病的典型症状，即腋芽芽体膨大并产生大量嫩芽， 嫩芽数明显多于空白对照，枝,梢失去顶端优势，节间明显变短。空白对照无任何畸形症状。从接种发病部位再次分离、培养得到相同,形态的病……
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